qPCR, photometrische Detektion

[Zewski]

Guten Abend,
ich habe ein paar Verständnisprobleme aufgrund von Informationsmangel zur qPCR. Aus meinem sonst sehr umfangreichem Bioanalytikbuch konnte ich nix dazu finden und im Internet erst recht nichts.
Folgendes: Die qPCR ist eine quantitative Methode für DNA. Dabei wird die Floureszenz von Interkalaten wie Ethidiumbromid oder SYBR Green oder von Molecular Beacons (kein Interkalat) gemessen. Meine Frage dazu wäre, dass wenn sich ein Interkalat im Primer einlagert, wird da nicht die Synthese von weiteren PCR-Fragmenten gestört? Oder wird vor jedem Primer Annealing das Flourophor ausgewaschen? Bei Molecular Beacons finde ich es noch schwieriger: Wenn während der Elongation Beacons an die ssDNA hybridisieren, dann wird die DNA-Pol. gestört? Oder wird zwischen dem Primer Annealing und der Elongation das Beacon ausgewaschen? Oder bin ich hier auf der komplett falschen Spur?

MfG
Zewski

[imalipusram]

Interkalationsfarbstoffe sollten nur dann interkalieren und dann verstärkt fluoreszieren, wenn DNA als Doppelstrang vorhanden ist. Also entweder, wenn der Primer gebunden hat oder Haarnadelstrukturen ausgebildet werden. Man kommt mit der Temperatur beim Annealing von oben, sollte also keine Probleme haben, sofern die Reaktion robust parametriert worden ist.

Zu den Beacons: Die werden im Fall der Quencher-Probes (zB TaqMan) von der Exonukleaseaktivität der Polymerase zerstört, sodaß die Fluoreszenz im Ansatz in Relation zum Amplifikat zunimmt.

Mehr Infos liefern Wikipedia und die Google Bildersuche.

[Zewski]

Zitat von imalipusram

Interkalationsfarbstoffe sollten nur dann interkalieren und dann verstärkt fluoreszieren, wenn DNA als Doppelstrang vorhanden ist. Also entweder, wenn der Primer gebunden hat oder Haarnadelstrukturen ausgebildet werden. Man kommt mit der Temperatur beim Annealing von oben, sollte also keine Probleme haben, sofern die Reaktion robust parametriert worden ist.

Zu den Beacons: Die werden im Fall der Quencher-Probes (zB TaqMan) von der Exonukleaseaktivität der Polymerase zerstört, sodaß die Fluoreszenz im Ansatz in Relation zum Amplifikat zunimmt.

Mehr Infos liefern Wikipedia und die Google Bildersuche.

Vielen Dank