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Alt 31.05.2018, 12:38   #1   Druckbare Version zeigen
Jacqueline_Rose weiblich 
Mitglied
Themenerstellerin
Beiträge: 2
LKZ Bestimmung

Hallo zusammen,

Ich studiere Geographie und habe Genetik als Nebenfach gewählt.
Ich soll nun für mein Protokoll die LKZ angeben.
Es handelt sich bei dem Versuch um das Klonieren von Bakterien.

Ausplattiert wurde folgendes:
Platte 1 - 100 ul
Platte 2 - 1:10 100 ul
Platte 3 - 1:10 90 ul
Platte 4 - 1:100 100 ul

Ausgezählt wurden
Platte 1 - 2 Kolonien
Platte 2 - 0 Kolonien
Platte 3 - 448 Kolonien
Platte 4 - 77 Kolonien

Wie kann ich daraus die LKZ ableiten?
Ich blicke da nicht so durch .

Vielen Dank im Voraus
Jacqueline_Rose ist offline   Mit Zitat antworten
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Alt 01.06.2018, 04:59   #2   Druckbare Version zeigen
imalipusram  
Mitglied
Beiträge: 6.572
AW: LKZ Bestimmung

War das einfach eine Bakterienverdünnung? Immer dieselbe? Hatten die Platten ein Antibiotikum? Hattet Ihr die Bakterien mit einem Plasmid transformiert oder was habt Ihr kloniert?
__________________
I solemnly swear that I'm up to no good!
伍佰 (WuBai - Run run run!) (ein Musikvideo mit dem Bambushaus und dem imalipusram unter den Statisten)
Noch ein nettes Video (nerdy, ein LIHA-Robot)
Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.
imalipusram ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 01.06.2018, 09:34   #3   Druckbare Version zeigen
Jacqueline_Rose weiblich 
Mitglied
Themenerstellerin
Beiträge: 2
AW: LKZ Bestimmung

Also hier eine kurze Beschreibung des Versuchs - ich gebe allerdings nur die Mengen an und werde die Schritte mit Inkubationszeiten etc. weg lassen:

1) EcoRI Verdau von Lambda DNA und pUC 19
Probe 1: 7 µl H2O, 1 µl pUC 19, 1 µl Puffer für EcoRI, 1 µl EcoRI
Probe 2: 16 µl Lambda DNA, 2 µl Puffer für EcoRI, 1 µl EcoRI

2) Dephosporylierung von pUC 19
In Probe 1: 1,2 µl Phosphatase Puffer, 1 µl Phosphatase

3) Ligation der Lambda-Fragmente in pUC 19
In Probe 2: 6 µl aus Probe 1
Probe 3: 10 µl aus Probe 2 (Mischung aus pUC 19 & Lambda DNA), 10 µl Ligase
Puffer, 1 µl Ligase

4) Transformation in kompetente Zellen (DH5 alpha)
Probe K: 10 µl Wasser, 0,5 µl pUC 19, 100 µl DH5 alpha
in Probe 3: 100 µl DH5 alpha

5) Ausplattieren
Probe 3 1:10 -> 10 µl aus Probe 3, 90 µl Medium
Probe K 1:10 -> 10 µl aus Probe K, 90 µl Medium
Probe K 1:100 -> 10 µl aus K 1:10, 90 µl Medium
Agarplatten bestanden aus Antibiotikum Ampicillin und X-Gal
Jacqueline_Rose ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 01.06.2018, 09:48   #4   Druckbare Version zeigen
biowiz  
Mitglied
Beiträge: 718
AW: LKZ Bestimmung

sieht komisch aus...
normalerweise macht man eine Verdünnungsreihe und plattiert die Lösungen aus, bei denen man am ehestern zwisch 30 und 300 cfu/Platte erwartet. Da das mitunter im Vorfeld nicht ganz klar ist, sind es immer mehrere verdünnungen, die plattiert werden.

Wenn Du deine Ursprungslösung mit 100 µl ausplattierst, hast du
100 µl = 0,1 ml = 10-1 ml
bei 45 Keimen auf diese Platte, die Du (beispielsweise auszählen würdest) hättest Du also 45 pro 100 µl; d.h. 450 pro ml.
Wenn Du aus der Darstellung oben den Faktor der Verdünnung (=10-1) zum Zurückrechnen benutz, musst Du das Vorzeichen logischerweise umkehren --> cfu x 101)

Das mach Sinn, wenn Du z.B. eine Reihe hast, die mehrere 10er Verdünnungsschritte beinhaltet:

1 ml Ausgangslösung /10 ml // 1 ml /10 ml // 1 ml / 10 ml // 1 ml / 10 ml
Das wären jetzt 4 sequentielle Verdünnungen um Faktor 10 --> 10-4.
Wenn Du dann von dieser Lösung 100 µl ausplattierst (statt 1ml) käme noch "auf Platte) eine weitere 10er Potenz dazu.

Zählst du dann auf der letzten Platte (mit 100 µl) z.B. 33 keime nach der Inkubation, hättest Du in Summe in der Ausgangslösung 33 * 105 cfu/ml.

Deine Werte spiegeln aber in keiner Weise eine "Verdünnungsreihe" wider; Max liegt mitten drin! Entweder wie schon abgefragt unterschiedliche Medien verwendet? falsch beschriftet? unsauber verdünnt? etc. da wäre vieles möglich.

Es ist überigens nicht unüblich, dass man 10er Stufen nicht (exakt) widerfindt wenn man mehrere Verdünnungsstufen ausplattiert; es bietet sich an immer mind. 2 Platten pro Verdünnung zu nehmen um Handhabungsfehler besser zu erkennen.
Das Zielfenster von 30-300 cfu/Platte ist sinnvoll; ist mehr drauf, gibt es eventuell einen bias zwischen den Kolonien oder ineinanderwachsen, bei weniger ist die Belastbarkeit des ermittelten Wertes zu gering (Fehler/Schwankungen wirken sich zu stark auf das Ergebnis aus).

Hoffe das hilft,
Viele Grüße
bw
biowiz ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 01.06.2018, 09:58   #5   Druckbare Version zeigen
biowiz  
Mitglied
Beiträge: 718
AW: LKZ Bestimmung

irgendwie scheint mir der Schritt ausplattieren in zweiten Beitrag und der Teil ausgezählte Platten im erst nicht deckungsgleich, oder?

Entscheide ddich über welche Lösung du etwas sagen möchtest un berechn dann den Anteil dieser Lösung in ml auf der Platte, auf der Du gezählt hast;

Allerdings wäre bei diesem Versuch doch sicher auch die eingesetzte Zellzahl an DH5a und in Folge der manipulation die Transformationseffizienz interessant; fürs "Plattieren" bieten sich andere Versuche an.


Grüße
bw
biowiz ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 01.06.2018, 10:57   #6   Druckbare Version zeigen
imalipusram  
Mitglied
Beiträge: 6.572
AW: LKZ Bestimmung

Zitat:
Zitat von Jacqueline_Rose Beitrag anzeigen
Also hier eine kurze Beschreibung des Versuchs
Das ist ja völlig chaotisch! Besser darstellen als Experiment 1,2,3, welche Verdünnung Du jeweils auplattiert hast und welche LKY jeweils rausgekommen ist. Und dann die richtigen Schlüsse daraus ziehen.

Vermutlich ging es Euch also darum herauszufinden, was Restrikionsenyzme und Ligasen so für einen Effekt auf ein Plasmid und eine Phagen-DNA mit Antibiotikaresistenz haben. Die Berechnung der LKZ erfolgt, wie schon von biowiz beschrieben, durch Rückrechnen auf 1ml unverdünnte Probe (oder meinetwegen relativ zur LKZ der verwendeten Bakterien).
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