Hallo, bekanntlich schneiden natürliche Restriktionsenzyme nur an bestimmten Gensequenzen. Sicherlich gibt es aber Gensequenzen, zu denen kein natürliches Enzym "passt".
Frage: Kann man inzwischen diese Enzyme künstlich modifizieren, so dass sie auch auch andere denkbaren DNA-Sequenzen schneiden? Und wo (oder unter welchem Stichwort) kann man darüber etwas erfahren?
Vielen Dank für eine Antwort
wvteeff
man kann auf jeden Fall künstliche Restriktionsenzyme herstellen.
Es gibt viele bekannte Protein-DNA-Bindungsdomänen, also Proteindomänen, die an bestimmte DNA-Stellen binden können. Eine solche Domäne verbunden mit einer Nuklease-Domäne kann dann an spezifischen Stellen die DNA durchtrennen.
Für ausführlichere Info würde ich dich in der Angelegenheit an den englischen Wikipedia-Artikel verweisen, der dafür einiges an Fachliteratur anführt.
Hallo, bekanntlich schneiden natürliche Restriktionsenzyme nur an bestimmten Gensequenzen. Sicherlich gibt es aber Gensequenzen, zu denen kein natürliches Enzym "passt".
Du hast Hinweise auf TALEN und CRISPR/Cas9 bekommen, insofern brauche ich dazu nicht mehr viel zu schreiben.
Diese Methoden sind aber zu aufwändig, um bspw. für Klonierungen verwendet zu werden. Praktisch besteht auch kaum das Problem, dass man keine passenden Restriktionsenzyme findet. Anders als in Schulbüchern falsch beschrieben, schneidet man nämlich normalerweise die "Gene" gar nicht aus der Spender-DNA aus.
Statt dessen geht man (zumindest bei Eukaryonten) von mRNA des Spenders aus und schreibt diese in cDNA um (warum?), daraus vermehrt man sich die gewünschte Sequenz mit einer PCR. Und für die PCR baust du Überhänge an die Primer, so dass man die gewünschten Schnittstellen an den Ende der entstehenden DNA-Stücke hat.
Wenn das gar nicht geht, kann man immer noch auf andere Klonierungsmöglichkeiten zurückgreifen, bspw. SLIC-Cloning.
Grüße,
Zara
__________________ Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
Wenn das gar nicht geht, kann man immer noch auf andere Klonierungsmöglichkeiten zurückgreifen, bspw. SLIC-Cloning.
Wenn man den gesamten Aufwand für eine PCR-Klonierung betrachtet, ist es idR deutlich günstiger, wenn man sich die cDNA of interest einfach chemisch synthetisieren läßt (1kB im Plasmid incl. Sequenzgarantie für deutlich unter 1kEuro). Dies hat den Vorteil, daß man jemand anderen dafür verantwortlich machen kann, wenn die Sequenz nicht stimmt (vgl. Polymerasefehler bei der PCR-Klonierung im Zusammenhang mit Murphy's Gesetzen) und man hat vor allem den Vorteil, daß man sich das Konstrukt so gestalten kann, wie man es braucht, zB mit optimierter codon-usage bei unterschiedlichen Spender- und Zielorganismen und abspaltbaren Tags für die Proteinaufreinigung oder den Nachweis mittels Antikörpern, etc. etc.
__________________ I solemnly swear that I'm up to no good! 伍佰 (WuBai - Run run run!) (ein Musikvideo mit dem Bambushaus und dem imalipusram unter den Statisten) Noch ein nettes Video (nerdy, ein LIHA-Robot) Und so gehts hier manchmal zu (sowas Ähnliches wie Fronleichnam, hier wird TuDiGong, dem Erdgott, tüchtig eingeheizt!) Oder so (auch ungeeignet für Gefahrstoffphobiker) und so und so.
Wenn man den gesamten Aufwand für eine PCR-Klonierung betrachtet, ist es idR deutlich günstiger, wenn man sich die cDNA of interest einfach chemisch synthetisieren läßt (1kB im Plasmid incl. Sequenzgarantie für deutlich unter 1kEuro). Dies hat den Vorteil, daß man jemand anderen dafür verantwortlich machen kann, wenn die Sequenz nicht stimmt
Ich denke, es kommt darauf an, was man macht und wie oft man Konstrukte kloniert:
Ich habe einmalig cDNA aus Mausgehirn und aus menschlichen Zellen (HeLa, HEK) erzeugt und daraus für meine ganze Doktorarbeit daraus kloniert. Wenn alles etabliert ist, machst du eine PCR, hast schon diverse geschnittene Vektoren in deiner Box, pickst nach der Ligation 3 Kolonien, davon mindestens 2 positiv, eine oder zwei Sequenzierungen und fertig. Das knappt in einer Woche und braucht vor allem Arbeitszeit, aber zumindest kosten Doktoranden ja auch nicht viel...
Für die Tags haben wir eine Reihe von Vektoren und statt Sequenzen zu optimieren, kann man natürlich auch optimierte Bakterien (Rosetta, RIL o.ä.) verwenden.
Es ist wahrscheinlich was anderes, wenn man einmalig ein Kontrukt haben will und das definitiv nicht anders bekommt. Dann kann man auch mal 600 Euro für eine Gensynthese auf Tisch legen.
Eines unserer Nachbarlabore hat inzwischen eine humane cDNA-Library gekauft, jede einzelne cDNA in einem lentiviralen Vektor und das schon fertig in Bakterien, in 96-well-Platten wegefroren. Und das Ganze ist "natürlich" kompatibel mit Gateway-Cloning.
__________________ Ich habe zwar auch keine Lösung, aber ich bewundere das Problem!
Hallo zusammen,
danke für die Debatte. Für mich zwar ein wenig Fachchinesisch, aber dennoch spannend.
Ich überlegte nur, wie man künstlich eine Kette von Aminosäuren zu einer Form verknoten kann, so dass sie zuverlässig an bestimmte Nukleotid-Sequenzen binden (und diese auch noch schneiden!). Als biochemischer Laie überlege ich, ob es nicht einfacher ist, ein Protein mit komplementären Nukleotiden auszustatten, die zuverlässig ihre Partner finden (so wie es in der CRISPR-Technologie geschieht). - Aber sicherlich lauern zahlreiche Probleme in der Kreation solcher Protein-DNA-Chimären.
Gruß
Wvteeff
Linear-Darstellung
