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Alt 18.12.2013, 22:22   #1   Druckbare Version zeigen
Tina G weiblich 
Mitglied
Themenerstellerin
Beiträge: 8
Aufkonzentrierung von GST ohne Aktivitätsverlust

Hallo,

ich habe aus E.coli und Chlorella vulgaris Gesamtproteine isoliert. Da die Konzentration für einen GST-Enzymtest zu niedrig ist, muss ich die Proteine aufkonzentrieren. Wie mache ich das am schlauesten ohne GST-Aktivität einzubüßen?

Für jegliche Hilfe bin ich dankbar.

Grüße
Tina
Tina G ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 19.12.2013, 09:58   #2   Druckbare Version zeigen
Lumpenstrumpf  
Mitglied
Beiträge: 1.047
AW: Aufkonzentrierung von GST ohne Aktivitätsverlust

Du machst doch wahrscheinlich einen Mini-Zellaufschluss - kannst du da eine "höher konzentrierte Bakteriensuspension" verwenden, denn dann wäre ja die Konzentration des Lysats höher.
Lumpenstrumpf ist offline   Mit Zitat antworten
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Alt 19.12.2013, 11:17   #3   Druckbare Version zeigen
Tina G weiblich 
Mitglied
Themenerstellerin
Beiträge: 8
AW: Aufkonzentrierung von GST ohne Aktivitätsverlust

Für E.coli war die Proteinkonzentration hoch genug, um aktiv GST nachweisen zu können.

Mit den Algen sieht das anders aus. Eine Erhöhung des Algen-Volumens ist nicht möglich. Die Proteiausbeute ist weit geringer im Vergleich zu E.coli. Hier muss ich die Proteine aufkonzentrieren.
Tina G ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 19.12.2013, 12:26   #4   Druckbare Version zeigen
Lumpenstrumpf  
Mitglied
Beiträge: 1.047
AW: Aufkonzentrierung von GST ohne Aktivitätsverlust

Ich kenn mich da leider nicht gut aus. Es gibt halt mehrere Verfahren zum Aufkonzentrieren, z.B. Fällung mit Ammoniumsulfat, das würde ich aber in deinem Fall nicht machen. Es ist halt immer die Frage, ob der Anteil an dem Enzym, welches du nachweisen willst, sich verändert. Das würde ja die Ergebnisse verfälschen, sicherlich willst du die ergebnisse ja vergleichen und quantifizieren, oder?

Vielleicht geht etwas in Richtung Ultrafiltration oder SpeedVac?
Lumpenstrumpf ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 19.12.2013, 13:49   #5   Druckbare Version zeigen
Tina G weiblich 
Mitglied
Themenerstellerin
Beiträge: 8
AW: Aufkonzentrierung von GST ohne Aktivitätsverlust

Erstmal will ich einen Vortest machen, ob mit diesem Enzymtest GST aktiv in den Algen nachgewiesen werden kann. Da kommt es noch nicht so darauf an, ob Protein-Verluste vorhanden sind. Für mich ist es nur wichtig, dass GST durch eine Fällung seine Aktivität nicht verliert. Nur weiss ich nicht genau, mit welcher Fällung man das am besten macht.

Wenn dann dieser Enzymtest mit Algen funktioniert, erfolgt die Aufreinigung dann z.B. über eine Säule (Äktaprime) oder Ultrafiltration.

Aber vorerst ist für mich nur wichtig, die Gesamtproteine aufzukonzentrieren um den GST Enzymtest an den Algen zu etablieren.
Tina G ist offline   Mit Zitat antworten
Alt 19.12.2013, 19:14   #6   Druckbare Version zeigen
Lumpenstrumpf  
Mitglied
Beiträge: 1.047
AW: Aufkonzentrierung von GST ohne Aktivitätsverlust

Achso, ok ... Ammoniumsulfatfällung könnte man probieren. Du kannst es ja mit den E. coli-Zellen probieren, und wenn's danach nicht mehr aktiv ist, siehst du es ja. Ansonsten kannst du es vielleicht auch über einen Spin-Konzentrator einfach aufkonzentireren? Bei der Ammoniumsulfatfällung werden die Proteine nicht denaturiert, und man kann die Proteine nach dem Fällen einfach in einem kleineren Volumen resuspendieren. Natürlich kann es sein, dass ein Protein das nicht mag - aber das muss man ausprobieren.

Was ist denn das Ziel der Aktion, erstmal schauen, ob GST in den Algen vorhanden ist? Könnte man da nicht einen Westernblot machen? Gibt's Gründe zu der Annahme, dass GST in Algen nicht aktiv ist?

Ansonsten kann man auch kleine Spinsäulchen kaufen, da etwas GST-Affinity-Material reintuen, daran sollte GST ja dann binden. Und dann in mehreren Runden ml-weise das Zelllysat drüber laufen kassen und schließlich eluieren. Dann müsste man halt das Gluthathion wieder loswerden ...

Was anderes fällt mir jetzt nicht ein. :-)

Ist das GST überexprimiert?

Geändert von Lumpenstrumpf (19.12.2013 um 19:28 Uhr)
Lumpenstrumpf ist offline   Mit Zitat antworten
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Stichworte
aktivität, aufkonzentrierung, fällung, fusionsprotein, gst

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